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高國政 顏錦1
(蘇州215011普強蘇州制藥有限公司;1蘇州215011蘇州中化藥品工業有限公司)
摘要
目的:研究樣品pH對細菌內毒素測定的影響。
方法:應用動態濁度法定量測定樣品中細菌內毒素的含量;由細菌內毒素參考標準品(RSE)制成兩種濃度的稀釋液,在14個pH量級上,與國內外兩種鱟試劑(TAL,LAL)反應;觀察每組平均回收率。
結果:pH梯度上,兩種鱟試劑回收曲線都呈現三個反應高峰,分別為pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH10.55。樣品pH在6～ 8間實驗結果穩定,4λ陽性對照的平均回收率為76.5%～ 115.9%和85.8%～ 99.8%;當樣品pH值≤ 3或≥ 12時,細菌內毒素試驗受到抑制,平均回收率≤ 56.8%。
結論:細菌內毒素試驗中應該調節檢品pH;使用TAL時,檢品pH應預調在(6.5～ 7.5)為好;使用LAL時,檢品pH應預調在(6.2± 0.1)或(6.7～ 7.8)為好。
關鍵詞 細菌內毒素;pH;鱟試劑(TAL,LAL);動態濁度法
細菌內毒素(endotoxin)主要存在于革蘭陰性菌細胞壁的最外層,當細菌死亡、裂解后才會釋放出來。其化學成分是磷脂-多糖-蛋白質復合物,主要成分為脂多糖(lipopolysa-charide,LPS),臨床上可引起發熱、微循環障礙、內毒素休克、DIC等癥狀[1]。在制藥工業中,細菌內毒素被認為是藥品熱原(pyrogen)的本質[2～ 3]。作為替代家兔熱原試驗的細菌內毒素試驗已被多國藥典收載。目前,美國藥品食品管理局(FDA)承認3種使用鱟試劑檢測細菌內毒素含量的方法,即凝膠(gel-clot)法、生色(chromogenic)法和動態濁度(kenitic-turbidimetry)法。中國藥典(1995年版)只采用凝膠法。我們應用動態濁度法,定量測定樣品中細菌內毒素,并同時使用了東方鱟細胞裂解物(tachypleus amebocyte lysate,TAL)和美洲鱟細胞裂解物(limulus amebocyte lysate,LAL)兩種鱟試劑,以探索在細菌內毒素試驗中,檢品pH對測試影響的程度。
1 材料和方法
1.1 試劑和儀器
美國藥典細菌內毒素參考標準品(RSE),10 000 EU·瓶- 1;TAL(廈門鱟試劑廠,批號960118,靈敏度0.125 EU·ml- 1,1 ml·瓶- 1;LAL(靈敏度0.125 EU·ml- 1,5.2 ml·瓶- 1;LAL溶解水批號4M0757,內毒素含量≤ 0.005 EU·ml- 1,pH 6.23);細菌內毒素測定儀;206型pH計;超凈工作臺。
1.2 樣品處理
氫氧化鈉(AR)經185℃ ,4 h烘烤,配制成飽和溶液。濃鹽酸(AR)不經處理。按中國藥典(1995年版)附錄XV F方法,配制成0.1 mol·L- 1的NaOH和HCl溶液,121 ℃滅菌3 h。配制中所用器材都除熱原。用新鮮滅菌注射用水(WFI,pH 5.61,內毒素含量 0.03 EU·ml- 1)作稀釋液。0.1 mol·L- 1鹽酸連續4次10倍量稀釋,0.1 mol·L- 1NaOH溶液連續6次10倍量稀釋,并采用LAL溶解水(pH6.23)和WFI(pH 5.61)制成14個量級的梯度pH溶液,分別加入RSE制成含細菌內毒素0.5 EU·ml- 1和0.125 EU·ml- 1的樣品。
1.3 測定原理和方法
一定量的細菌內毒素和鱟試劑在37℃孵化時,混合物的濁度隨時間而變化,在反應進行一半(t50)時,混合物濁度的變化速率最快。細菌內毒素測定儀可自動測定各濃度值下的t50,經分析計算后繪制標準曲線,測定方法見表1。陰性對照、陽性對照、空白對照同時立時,測定結果有效。異常值的舍棄依據Smirmoffsl法(n= 4,α0.01= 1.493)。
1.4 標準曲線
1.4.1 LAL標準曲線 按USP規定方法使用RSE,配制稀釋液組,標準曲線方程為lg t=0.960 0- 0.386 0 lg c,r= - 0.998 8(n= 4),線性范圍0.031 3 EU·ml- 1～ 10.012 8 EU·ml- 1,λ= 0.031 3 EU·ml- 1。
1.4.2 TAL標準曲線 標準曲線方程為lg t= 3.143 2- 0.386 8 lg c,r= - 0.997 9(n=4),線性范圍0.125 3 EU·ml- 1～ 10.816 4 EU·ml- 1,λ= 0.125 3 EU·ml- 1。
2 結 果
2.1 試驗分成3組,每組有14個樣品,其pH遞增。第1組加樣品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和TAL 0.1 ml,該樣品中RSE濃度為4λ。第2組加樣品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml。第3組加樣品0.2 ml(含0.125 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml,該樣品中RSE濃度也為4λ。根據各樣品的t50,計算回收結果,見表2。pH在4～ 11之間,RSD為1.16%～ 12.29%,s為0.005 0～ 0.054 6,實驗的精密度較好。本實驗結果發現,兩種鱟試劑(TAL,LAL)在pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH 10.55處均有凝集高峰,當pH≤ 3或pH≥ 12時,細菌內毒素試驗受到明顯抑制(平均回收率≤ 56.8%),見圖1。兩種鱟試劑在pH梯度上的回收有差別,但在pH6～ 8間,回收曲線穩定。
2.2 以pH梯度為橫軸,繪制質控圖。圖中可見幾何平均值( x)、最大值和最小值,可同時觀察試驗的準確度和精密度。依據FDA規定,4λ陽性對照的回收應在標準曲線± 25%以內[2],此處判斷動態濁度法檢驗有效的標準是平均回收率達到(100± 20)%,相應的警戒線為(100±10.7)%。因此,對TAL允許測量值為(0.5±0.1)EU·ml- 1,警戒值為(0.5± 0.053 3)EU·ml- 1,見圖2。圖中顯示:TAL實驗的最佳pH為6.68～ 7.12,此時準確度和精密度較為滿意,在pH 6.23和pH 7.83均有測量值逸出允許范圍。對LAL允許測量值為(0.125±0.025)EU·ml- 1,警戒值為(0.125± 0.013 3)EU·ml- 1,見圖3。圖中顯示:LAL實驗的pH值在6～ 8都滿足試驗的要求,在pH 6.23處,反應可取得較佳回收,在pH6.68～ 7.83時,回收較為穩定。
2.3 反應結束后(t> 4200 s),用pH試紙測定反應混合物pH值,結果見表3。
2.4 觀察酸堿對內毒素的破壞作用 0.1 mol·L- 1HCl溶液加入RSE,配成含細菌內毒素1EU·ml- 1的溶液,常溫放置3 h,加等量0.1 mol·L- 1NaOH溶液中和后,測得濃度小于0.031 3EU·ml- 1。同法做堿處理組,其測定值為0.533 3 EU·ml- 1(平均回收率為106.7%,RSD= 7.3%,n= 4)。結果表明:常溫下強酸液(pH 1)對內毒素有較強的破壞作用,而強堿(pH 13)則無。關于酸或堿對內毒素的滅活還須進一步研究。
3 討 論
3.1 鱟血細胞溶解物中的凝固酶原,能夠被微量的細菌內毒素激活生成凝固酶,促使可凝蛋白向凝固蛋白轉化,最終形成凝膠樣物質,這是一個極復雜的鏈式酶原反應[4]。該反應極其靈敏,凝膠形成速率與內毒素濃度成正比,并受溫度、反應物中Ca2+/Mg2+離子濃度和pH等因素的影響[4～ 5],溫度和pH值的差異直接會影響到多種因子和蛋白質的活性,影響可凝蛋白的轉化和凝膠的形成,引起結果的差異。
3.2 在細菌內毒素試驗中，對于樣品PH問題，《美國藥典XX版》規定PH在6-7.5之間，美國藥典XXⅢ版中此項規定放寬至PH6-8[6~8]，英國藥典（1993年版）規定為PH6.5~7.5[5]。中國藥典(1995年版)對此未作具體規定。根據國內外資料的報道,試驗的最適pH在6～ 7.5,6.25～7.25或6～7等,這些結論多是以凝膠法中凝膠強度的細微差別來判斷,存在較大的主觀差異,國內也有報道認為大輸液不用調pH值。我們認為pH的調節是必要的,即使樣品pH在6～8之間,仍存在規律性的變化,因而不同次的測定中,應調節檢品pH值,盡量與標準曲線制作(或鱟試劑靈敏度復核)時的pH相一致。
3.3 我們應用動態濁度法,儀器和操作者資格均經過驗證。本法使用0.2 ml的樣品和0.1ml的鱟試劑反應,樣品使用量比凝膠法大,因此兩種測試方法中pH對細菌內毒素測定的影響可能不完全一樣,但從混合物最終pH來看(表3),鱟試劑本身具有一定的緩沖能力。當樣品pH在5.20～ 9.17時,用pH試紙測得混合物pH基本為7,在這個范圍內,動態濁度法仍顯示了不同pH對測定結果有較大影響,其原因可能是混合物最終pH的細微差異會較大程度地影響凝膠的形成,但也不排除樣品pH對鱟試劑中活性成分的影響,從這個角度講,在pH問題上,兩種測試方法是一致的。
3.4 細菌內毒素試驗用于臨床細菌內毒素血癥(endotoxemia)和注射劑如粉針、水針及生物制品的測試時,由于這些檢品本身具有一定的緩沖能力,當其pH越偏離6～ 8之間時,對細菌內毒素測定的影響也會越大。
參考文獻（略）
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