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腸功能恢復湯對MODS大鼠細菌和內(nèi)毒素移位及血清MDA和SO
作者：王春榮，程永剛，曾 津 作者單位：西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院：1. 普通外科；2. 泌尿外科，陜西西安 710061
【摘要】
目的 通過建立SD大鼠MODS模型，觀察腸功能恢復湯對多器官功能障礙綜合征(MODS)大鼠細菌和內(nèi)毒素移位及血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的影響，探索MODS新的防治途徑。
方法 SD大鼠57只，隨機分為對照組、MODS模型組、腸功能恢復湯治療組和氨芐西林治療組，分別檢測各組外周靜脈血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物的內(nèi)毒素含量，測定血清MDA、SOD含量和ALT、AST、Cr及BUN含量，同時取腸系膜靜脈血、腸系膜淋巴結、肝、腎、肺和脾組織進行細菌培養(yǎng)，觀察細菌移位情況，取回腸組織制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。
結果 模型組、腸功能恢復湯組和氨芐西林組的肝腎功能受到明顯的損害，回腸黏膜不同程度發(fā)生上皮細胞水腫、壞死、脫落、絨毛損傷斷裂、炎細胞浸潤；腸功能恢復湯組與模型組相比，外周血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物的內(nèi)毒素含量、血清MDA、ALT、AST、Cr及BUN含量均顯著降低(P<0.01)，SOD含量顯著升高(P<0.01)，但氨芐西林組與模型組相比上述指標差異不明顯(P>0.01)。在模型組與氨芐西林組內(nèi)，MDA和SOD的含量呈負相關(P<0.01)。腸功能恢復湯組和氨芐西林組的細菌移位率均比模型組低，二者間無顯著性差異(P>0.01)。結論 腸功能恢復湯能抑制MODS大鼠的細菌、內(nèi)毒素移位和氧化抗氧化失衡。
【關鍵詞】 腸功能恢復湯；多器官功能障礙綜合征(MODS)；細菌和內(nèi)毒素移位；丙二醛(MDA)；超氧化物歧化酶(SOD)
器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是臨床上常見的危重癥之一。腸道不僅在維持機體正常營養(yǎng)及生理機能中起著極其重要的作用，同時還活躍地參與創(chuàng)傷、燒傷和感染后的各種應激反應，是MODS發(fā)生的始動器官[12]。近年來，國內(nèi)已有很多學者[34]應用中醫(yī)“通里攻下”的理論，對MODS的防治作了較為深入的研究。研究結果表明：通里攻下法可有效保護腸黏膜屏障，減少細菌和內(nèi)毒素移位，減輕全身炎性反應和降低血清內(nèi)毒素水平。腸功能恢復湯由大黃、丹參等10余味中藥組成，具有通里攻下、活血化淤等作用。本實驗通過建立SD大鼠MODS模型，觀察腸功能恢復湯對MODS大鼠細菌和內(nèi)毒素移位及血清丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量的影響，探索MODS新的防治途徑。
1 材料與方法
1.1 材料 SD大鼠57只，清潔級，雌雄不限，體重(248.3±16.3)g。T6型新世紀紫外分光光度計；超速離心機；OLYPAS光學顯微鏡(日本)；顯色基質鱟試劑盒和除熱原耗材均購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；MDA、SOD、ALT、AST、Cr、BUN試劑盒，氨芐西林。
腸功能恢復湯由大黃20g(后放入)、丹參12g、黨參15g、白術15g、陳皮15g、木香12g、桃仁12g、赤芍15g、火麻仁30g、枳實12g等組成。濃縮煎制成濃度為1∶1的藥液(含生藥1g/mL)，滅菌處理后4℃冰箱內(nèi)保存。
1.2 MODS動物模型的建立 通過腸缺血再灌注聯(lián)合盲腸結扎穿孔法建立大鼠MODS模型[56]。大鼠于造模前24h禁食，自由飲水。稱重后給予腹腔注射100mL/L水合氯醛(30mg/100g)麻醉，實驗臺上仰臥固定，腹部脫毛后常規(guī)消毒鋪無菌巾，取腹部正中切口進腹，暴露腸系膜上動脈(superior mesenteric artery, SMA)，各組分別用無創(chuàng)夾夾閉其根部45min，松夾即為再灌注。在進行SMA夾閉期間，間斷地向腹腔內(nèi)注射等滲鹽水，總量約15～20mL/kg，以預防或減輕在松開動脈夾后出現(xiàn)的一過性低血容量反應。同時，游離盲腸，注意保護腸系膜血管，找到盲腸與回結腸交界處，距回盲交界約1cm處游離出回盲動脈，于動脈弓內(nèi)側，穿過4號絲線，并環(huán)行結扎盲腸，注意保持回結腸通暢。在盲腸游離端用9號針頭貫穿2次穿孔，直徑約2mm，將盲腸放回腹腔后關腹。建成大鼠MODS模型。
1.3 動物分組 57只大鼠隨機分為3組，正常對照組(control group)12只：正常大鼠腸功能恢復湯灌胃；MODS模型組(MODS group)15只：造模后生理鹽水灌胃；腸功能恢復湯治療組(decoction group)15只：造模后即給予腸功能恢復湯灌胃；以上三組均10mL/kg體重，2次/d，連續(xù)2d。氨芐西林治療組(ampicillin group)15只：造模后即給予氨芐西林灌胃，89.25mg/kg體重，2次/d，連續(xù)2d。
1.4 血清內(nèi)毒素含量的測定 各組動物于造模成功48h后，用100mL/L水合氯醛(30mg/100g)麻醉，嚴格無菌操作下用無熱原注射器采取門靜脈血、外周血，迅速低溫離心10min(1000r/min)，吸出上清液，以鱟試驗偶氮基質顯色法定量測定，結果以eu/mL表示，嚴格按說明書操作。
1.5 回腸內(nèi)容物的內(nèi)毒素含量的測定 各組造模動物于麻醉后取回腸末端內(nèi)容物，稱重后加入無熱原鹽水混勻并離心(4℃，5000r/min，10min)。上清液以無熱原水連續(xù)10倍稀釋6次后以鱟試驗偶氮基質顯色法定量測定，結果以106 eu/g表示。
1.6 MDA和SOD含量的測定 MDA用硫代巴比妥酸法(TBA法)測定，SOD用黃嘌呤氧化酶法測定，均嚴格按說明書操作。
1.7 血清丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、肌酐和尿素氮含量的測定 各組動物于造模成功48h后，于麻醉狀態(tài)下，嚴格無菌操作下采取下腔靜脈血，用賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的含量，用脲酶法測血清尿素氮(BUN)的含量，用除蛋白法測血清肌酐(Cr)的含量。
1.8 細菌的培養(yǎng) 各組動物于造模成功48h，麻醉后無菌條件下打開腹腔，分別取腸系膜淋巴結(mesenteric lymph node, MLN)、肝、腎、肺及脾組織各0.5g，加入生理鹽水1mL制成勻漿，取勻漿液0.5mL，接種于直徑10cm的中國蘭培養(yǎng)基平皿內(nèi)，同時取腸系膜上靜脈血0.5mL加入培養(yǎng)基中作細菌培養(yǎng)，37℃條件下孵育48h，如果培養(yǎng)基平皿菌落數(shù)多于100個/g組織記為細菌培養(yǎng)陽性，細菌移位率按細菌培養(yǎng)的陽性臟器數(shù)/培養(yǎng)臟器總數(shù)計算。
1.9 小腸黏膜病理形態(tài)學的觀察 各組動物于造模成功48h，麻醉后于距盲腸5cm處取回腸組織，100mL/L甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE 染色，光鏡下觀察。
1.10 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。進行完全隨機設計資料的多個樣本均數(shù)比較的單因素方差分析，如差異有顯著性意義，采用SNKq檢驗進行多個樣本均數(shù)間多重比較。細菌移位率采用Fisher確切概率法進行檢驗。相關性檢驗采用線性相關分析。P<0.01認為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結 果
2.1 MODS模型組大鼠的一般情況和死亡率的變化 模型組動物于造模6h后即表現(xiàn)出反應遲鈍、活動減少、腹瀉、呼吸窘迫、足尾潮紅、口唇發(fā)紺等表現(xiàn)，開腹后可見腹腔內(nèi)大量膿性滲出液，腸蠕動極弱甚至消失，腸漿膜面充血水腫，表面有膿苔，肝臟水腫，表面可見大量出血點，總死亡率為33.33%。腸功能恢復湯組的總死亡率為26.67%，氨芐西林組的總死亡率為33.33%，兩組大鼠的一般情況和開腹后所見均好于模型組。
2.2 模型組和腸功能恢復湯組大鼠回腸組織的病理學觀察 光鏡顯示模型組回腸黏膜上皮細胞水腫、壞死、部分脫落、絨毛損傷斷裂和炎細胞浸潤(圖1A)，腸功能恢復湯組的病理形態(tài)較模型組好(圖1B)。
2.3 各組大鼠血清ALT、AST、BUN和Cr含量的比較 模型組、腸功能恢復湯組和氨芐西林組的肝、腎功能受到明顯的損害，腸功能恢復湯組與模型組相比，血清中ALT、AST、BUN和Cr含量均顯著降低(P<0.01)，但氨芐西林組與模型組相比上述指標差異不明顯(P>0.01，表1)。
2.4 各組大鼠門靜脈血、外周血和回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量的比較 腸功能恢復湯組與模型組相比，外周血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量均明顯降低(P<0.01)，而氨芐組與模型組相比上述指標差異不顯著(P>0.01，表2)。 表1 各組大鼠血清ALT、AST、Cr和BUN含量的比較表2 各組大鼠外周血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量的比較
2.5 各組大鼠細菌移位情況的比較 正常對照組大鼠僅在MLN中培養(yǎng)出細菌；模型組細菌移位率最高，為88.33%；腸功能恢復湯組細菌移位率為43.94%，氨芐西林治療組細菌移位率為46.67%，二者與模型組相比，細菌移位率顯著下降(P<0.01)，二者間差異不顯著(P>0.01，表3)。表3 各組大鼠細菌移位情況的比較
2.6 各組大鼠血清MDA和SOD含量的比較 腸功能恢復湯組與模型組相比，MDA含量明顯降低(P<0.01)，SOD明顯升高(P<0.01)，而氨芐西林組與模型組相比，MDA和SOD含量差異不明顯(P>0.01)。在模型組與氨芐西林組內(nèi)，MDA和SOD的含量呈負相關(r=-0.864，P<0.01；r=-0.808，P<0.01，表4)。表4 各組大鼠血清MDA和SOD含量的比較
3 討 論
本研究通過小腸缺血再灌注聯(lián)合盲腸結扎穿孔法建立SD大鼠MODS模型，結果顯示，模型組的肝腎功能受到明顯的損害，肝臟水腫，表面可見大量出血點，腸蠕動極弱甚至消失，腸漿膜面充血水腫，表面有膿苔。表明已成功建立SD大鼠MODS模型。腸功能恢復湯能顯著減輕MODS大鼠的細菌和內(nèi)毒素移位，并抑制氧化抗氧化系統(tǒng)的失衡。
腸功能恢復湯由大黃等10余味中藥組成，大黃導熱瀉下，火麻仁潤腸通便，枳實行氣破結，白術、陳皮健脾和胃，黨參益氣補中，丹參活血通經(jīng)，桃仁、赤芍活血化淤，木香行氣。在我院已有三十余年的臨床應用，具有促進腸蠕動，促進術后胃腸道功能恢復及腸道營養(yǎng)吸收等作用，但對細菌和內(nèi)毒素移位和機體氧化抗氧化系統(tǒng)的影響目前尚未有相關研究。
目前，國內(nèi)外對MODS的發(fā)病機制有三種假說：即腸道細菌與內(nèi)毒素移位學說、微循環(huán)障礙學說和細胞因子和炎癥介質學說[7]。當機體遭受嚴重創(chuàng)傷、休克、感染等打擊后，可相繼出現(xiàn)多種細胞因子及炎性介質的瀑布樣釋放和一系列病理生理改變；腸道菌群生態(tài)平衡破壞，革蘭氏陰性細菌過度生長，腸黏膜屏障破壞等而導致腸道細菌與內(nèi)毒素移位，出現(xiàn)敗血癥及內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素又可激活巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等，釋放多種炎性介質，形成惡性循環(huán)。因此，保護腸黏膜屏障及其功能，抑制細菌和內(nèi)毒素移位，阻滯這一惡性循環(huán)，對于MODS的防治具有十分重要的意義。
本研究發(fā)現(xiàn)，MODS模型組大鼠發(fā)生了明顯的細菌和內(nèi)毒素移位，腸功能恢復湯治療組的外周血、門靜脈血和回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量明顯降低，肝、腎等臟器的細菌移位率明顯降低。其機制可能有以下幾點：①腸功能恢復湯對腸道內(nèi)內(nèi)毒素的稀釋和物理沖洗作用減低了內(nèi)毒素的濃度；②火麻仁、白術[8]可以促進胃腸道蠕動，從而加速了腸道內(nèi)細菌和內(nèi)毒素的排出，同時抑制細菌的定植，減少了內(nèi)毒素的產(chǎn)生；③大黃、木香、丹參、黨參[8]均有不同程度的抗菌作用，可以抑制腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡紊亂，保護腸黏膜的生物屏障。此外，丹參、黨參等還有擴張胃腸道血管、改善微循環(huán)和促纖溶、抗血栓形成的作用，以此保護腸黏膜，減輕了內(nèi)毒素移位。氨芐西林等抗生素雖然有較強的抗菌能力，但在大量殺滅敏感細菌的同時，因菌體破裂而產(chǎn)生更多的內(nèi)毒素，還可能破壞腸道細菌的微生態(tài)平衡，破壞腸道生物學屏障從而進一步加重細菌和內(nèi)毒素移位及其對機體的損傷。
本研究發(fā)現(xiàn)，腸功能恢復湯可以抑制MODS大鼠的氧化抗氧化系統(tǒng)失衡。而氨芐西林的這一作用不明顯。其機制可能為：①大黃、丹參、桃仁等的中藥成分增強了機體的抗氧化能力，抑制了活性氧類物質對細胞的損傷；②黨參、丹參等可以改善微循環(huán)和促纖溶，保護組織細胞，減少活性氧類物質的產(chǎn)生；③腸功能恢復湯能減少腸道內(nèi)內(nèi)毒素的產(chǎn)生，減輕細菌和內(nèi)毒素的移位，從而保護肝、腎、肺等重要組織器官的功能，更好地維持機體氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡。
綜上所述，與傳統(tǒng)的“通里攻下”湯劑大承氣湯相比，腸功能恢復湯從多方位、多途徑顯著減輕MODS大鼠的細菌和內(nèi)毒素移位，抑制氧化抗氧化系統(tǒng)的失衡，但其具體機制還有待于進一步深入研究。
參考文獻（略）
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