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LAL試驗快速檢測肉品細菌污染程度及鮮度的研究
兀 征,王登臨,董瑞鵬,楊紅巖,張 蕾
(甘肅省動物檢疫總站,甘肅蘭州730030)
[摘要]
對不同鮮度的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和魚肉進行活菌總數、革蘭氏陰性菌數、大腸菌群數及揮發性鹽基氮(TVB_N)測定,并與LAL試驗(鱟變形細胞溶解物試驗)進行平行對比研究,證實肉品的鮮度與其細菌總數、革蘭氏陰性菌數及LAL指數呈負相關性。應用LAL試驗可在短時間(1～ 2小時)內快速判定肉品的細菌污染程度及鮮度,比傳統的細菌培養計數法大大縮短了時間,適合現場大批量肉品細菌污染程度及鮮度的快速檢測。
關鍵詞: 肉品; 細菌污染; LAL試驗; 快速檢測
中圖分類號: S852.61 文獻標識碼: A 文章編號:1008_0589(2002)04_0304_06
Rapid Determination of Bacterial Contamination and Freshness of Meat by LAL TestWUZheng,WANG Deng_lin,DONG Rui_peng,YANG Hong_yan,ZHANG Lei(Gansu Provincial Animal Quarantine Station 730030,China)Abstract: Three different freshness samples of pork,beef,mutton,chicken and fish were examined for the numbers of total viable cells,gram_negative organisms,colifrom groups and the value of TVB_N.The resultswere comparedwith those of LALtest(limulus amoebocyte lysatetest).A positive correlationwas observed among the total viable cells,gram_negative organisms and LALindexes. It indicated that LALtest in-dex can be used to determine the bacterial contamination and freshness of the meat rapidly.
Key words: Meat;Bacterial contamination;LALtest;Rapid determination
肉品的衛生質量關系到廣大人民群眾的食肉安全,而肉品細菌污染程度是反映其衛生質量的重要指標。快速準確檢測肉品細菌污染程度及鮮度,保證廣大消費者吃上“放心肉”,是動物檢疫機構和衛生部門亟待解決的問題。目前,國內檢測肉品新鮮度的主要方法是感官鑒定和實驗室揮發性鹽基氮(TVB_N)測定。感官鑒定的不足之處是結果不易量化,存在主觀性和片面性;TVB_N測定變化有時不敏感,肉品變質程度與肉品中TVB_N含量變化呈非正相關[1]。肉品細菌污染程度的檢測是判定肉品鮮度的一種準確、客觀的方法,常用的為細菌活菌總數培養計數法和大腸菌群數測定法,但檢驗一個樣品至少需用48小時,費時費力,很不適應于當今快速肉品消費市場的檢測[1]。
細菌的快速檢測,是指在檢驗樣品的過程中,無需進行細菌的分離培養、生化試驗等項目的檢驗,而是利用一定的方法在幾小時甚至更短的時間內從樣品中直接確定是否有細菌、細菌代謝產物存在,定性、定量,以達到對細菌污染程度進行判定的目的。國外對肉品中細菌快速檢測已建立了如基因探針檢驗、氣相色譜及免疫酶等多種方法,但這些方法主要用于一些特異性病原菌的檢測,很難全面反映肉品細菌的污染程度,且所需試劑昂貴,設備要求高,未能得到廣泛應用。
肉品細菌污染主要是由畜禽屠宰加工過程中革蘭氏陰性腸道細菌所致。革蘭氏陰性細菌胞壁中含有特殊成分—脂多糖,即為革蘭氏陰性菌內毒素。鱟血細胞內含有可凝蛋白、B因子、凝固酶原等蛋白凝固因子,內毒素同鱟試劑反應可形成肉眼可見的凝膠。國外學者已對利用LAL試驗快速檢測肉品細菌污染程度進行了一些研究[2,3]。國內一些研究人員已把LAL試驗用于食品中細菌內毒素含量的測定[4],但在檢測肉品細菌污染程度及新鮮度方面的應用還未見報道。
1 材料和方法
1.1 鱟試劑 靈敏度為2EU/ml,由廈門鱟試劑廠提供,批號為980708和981103。每批使用前按說明用內毒素陽性標準品測定其靈敏度。
1.2 鱟試劑溶解水及稀釋液 鱟試劑溶解水為廈門鱟試劑廠生產的無熱原水;稀釋液為LAL試驗檢測陰性的注射用生理鹽水。
1.3 細菌培養基及化學試劑 營養瓊脂、乳糖膽鹽發酵培養基、乳糖發酵培養基、伊紅美藍瓊脂均為成品培養基;所用化學試劑均為分析純級。
1.4 試驗肉品 豬肉:市場采集的一級鮮度肉28份,二級鮮度肉2份;人工二級鮮度肉5份,人工變質肉11份;牛肉:市場采集的一級鮮度肉5份;人工二級鮮度肉5份,人工變質肉3份;羊肉:市場采集的一級鮮度肉3份;人工二級鮮度肉3份,人工變質肉2份;雞肉:市場采集的一級鮮度肉6份;人工二級鮮度肉3份,人工變質肉2份;魚肉(淡水魚):市場采集的一級鮮度肉6份;人工二級鮮度肉2份,人工變質肉2份(人工二級鮮度和人工變質肉是將新鮮肉在室溫下或在37℃恒溫箱內放置一定時間后獲得)。
1.5 LAL試驗方法 將鱟試劑安瓿打開,加入0.1ml鱟試劑溶解水使凍干物充分溶解,然后加入等量的待檢肉樣稀釋液,搖勻置37± 0.5℃恒溫水浴鍋中靜置60± 2分鐘,取出后觀察結果。同時設陰性對照、陽性對照及抑制對照。鱟試劑凝固,呈膠凍狀,倒轉180度凝塊不變形、不流動判為陽性。以出現陽性反應的肉樣稀釋液最高稀釋倍數計算LAL指數(為使鱟試劑發生凝固的肉樣稀釋液10倍稀釋的最高稀釋度指數)及肉毒素含量。
1.6 肉樣處理和稀釋 在肉樣的精瘦肉處,從約4cm2大小范圍內由表層向深層取5g肉,置滅菌燒杯中剪碎,加入45ml生理鹽水,放在磁力攪拌器上攪拌10～ 15分鐘,即成1∶10的肉浸液。吸取肉浸液1ml加入裝有9ml生理鹽水的試管中,充分混勻,即成1∶102稀釋液。依據肉樣新鮮程度(感官判定)依次稀釋至1∶105～ 1∶108。制備的稀釋液同時用于微生物學試驗及LAL試驗。
1.7 新鮮度鑒定及TVB_N測定 按GB5009.44_85《肉與肉制品衛生標準分析方法》進行。
1.8 活菌總數及大腸菌群數測定 按GB4789.2_84和GB4789.3_84《食品衛生微生物學檢驗》進行。
1.9 革蘭氏陰性菌數測定 選擇3個稀釋度肉樣稀釋液,接種伊紅美藍瓊脂平板,每個稀釋度接2個平板,每個平板接種0.2ml,搖勻后37℃培養48小時,計數生長的菌落。
1.10 LAL指數與細菌總數、革蘭氏陰性菌數、大腸菌群數及TVB_N值相關性對比分析 按生物統計學原理計算相關系數(r),分析LAL指數與其他試驗數值之間的相關程度。
2 結 果
2.1 肉品感官鑒定、TVB_N和微生物學指標測定及LAL試驗 由表1～ 5可見,不同種類、不同新鮮度的肉樣88份,隨著肉品新鮮度的降低,活菌總數、革蘭氏陰性菌數及大腸菌群數對數值均相應升高,LAL指數和肉品內毒素含量也都相應升高;TVB_N值在豬肉、牛肉和羊肉也都出現相應變化;不同新鮮度之間的各數值(除雞魚肉TVB_N值)有顯著差異(p< 0.01)。同等鮮度牛、羊肉TVB_N值、活菌總數、革蘭氏陰性菌數及LAL指數相近,無顯著差異(p> 0.05);但不同鮮度之間各數值有顯著的差異(p< 0.01)。因此,牛肉和羊肉可用同一指標進行判定。
2.2 LAL指數與活菌總數、革蘭氏陰性菌數、大腸菌群及TVB_V值相關性對比分析 用生物統計學原理計算相關系數(r),結果見表6。LAL指數與活菌總數、革蘭氏陰性菌數、大腸菌群數及TVB_V值的相關系數(r)均值分別為0.955、0.948、0.813和0.363;與其相關性依次為活菌總數>革蘭氏陰性菌數>大腸菌群數> TVB_V值。
參考文獻（略）
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